I giardini della regina a Madrid
Al ballo della Regina, l’affaticata Elisabetta chiede a Eboli di prendere il suo posto, indossando il suo manto, i gioielli e la maschera. Eboli, travestita da Regina, consegna a un paggio un biglietto galante per Carlo. Carlo, ingannato da un biglietto che lo invita a un appuntamento notturno, si prepara a un convegno amoroso con Elisabetta. Appare, invece – con il volto velato – la principessa d’Eboli, alla quale egli dichiara il proprio amore (Duetto: Se tu, bella adorata). Quando il giovane si accorge dell’equivoco, non riesce, tuttavia, a celare un moto di stupore. Eboli, comprende, allora, il segreto rapporto che lega Carlo alla regina e – folle di gelosia – giura di vendicarsi. A nulla vale l’intervento di Rodrigo che cerca di giustificare l’amico e minaccia di morte Eboli, per imporle il silenzio (Terzetto: Al mio furor sfuggite invano). Il marchese di Posa invita, quindi, Carlo a consegnargli i documenti provenienti dalle Fiandre, che tiene presso di sé.

Una gran piazza innanzi Nostra Donna d’Atocha
Il popolo canta la propria gioia, mentre i frati conducono al rogo di condannati dal Santo Uffizio (Coro: Spuntato ecco il dì d’esultanza). Dopo l’ingresso della corte, un gruppo di fiamminghi – guidati da Carlo – si getta ai piedi del sovrano, invocando giustizia per la propria patria. Filippo rifiuta di ascoltarli e dà ordine di allontanare i ribelli (Concertato: Sire, no, l’ora estrema). Carlo, allora, dopo avere vanamente richiesto al padre il permesso di recarsi nelle Fiandre, sguainando la spada, si schiera al fianco del popolo fiammingo. Il sovrano risponde all’affronto ordinando di disarmare il figlio che nessuno osa avvicinare. Solo l’intervento di Rodrigo evita lo scontro diretto: egli toglie la spada all’Infante e la porge al re. Il corteo riprende il suo cammino per assistere al supplizio degli eretici, mentre una voce dal cielo invoca la pace eterna.