Il chiostro del convento di San Giusto
Un frate prega innanzi alla tomba di Carlo V, mentre Don Carlo, Infante di Spagna, ricorda il primo incontro con l’amata Elisabetta di Valois, sua promessa sposa, ma ora moglie del padre Filippo II e regina di Spagna (Aria: Io la vidi e il suo sorriso). All’apparire di Rodrigo, marchese di Posa – che, di ritorno dalle Fiandre, annuncia la sollevazione di quella regione vessata dalla corona spagnola – Carlo ha un moto di gioia. Egli può confidare il proprio amore per Elisabetta all’amico che, pronto a soccorrerlo, gli ingiunge di dimenticare i propri affanni, recandosi nelle Fiandre per placare le persecuzioni religiose. Al termine del colloquio, Carlo e Rodrigo giurano reciproca amicizia, mentre il re e la regina attraversano il chiostro per entrare nel convento (Duetto: Dio, che nell’alma infondere).
 

Un sito ridente alle porte del chiostro di San Giusto
Le dame di corte attendono la regina, mentre la principessa d’Eboli intona una canzone, accompagnata dal paggio Tebaldo (Aria: Nel giardin del bello). Al suo arrivo, Elisabetta incontra il marchese di Posa dalle cui mani riceve una lettera inviatale dalla madre e – nascostamente – un biglietto in cui Carlo la prega di affidarsi a Rodrigo.Questi la invita a incontrare il figlio e a perorarne la causa presso il re (Aria: Carlo, ch’è sol). Eboli, a sua volta, crede di riconoscere nell’agitato stato d’animo di Carlo – che ella segretamente ama – una prova d’amore nei suoi confronti. Introdotto al cospetto della regina, il giovane chiede a Elisabetta di intercedere presso il re affinché gli conceda di partire per le Fiandre. Ma ben presto il dialogo si muta in una dichiarazione d’amore, interrotta da Elisabetta che ricorda a Carlo l’impossibilità di realizzare la loro unione (Duetto: Perduto ben, mio sol tesor).

Il giovane si allontana disperato, mentre la regina – rimasta sola – implora l’aiuto divino. Sopraggiunge il re, che, trovata la consorte senza il seguito reale, condanna all’esilio la contessa d’Aremberg, rea di essersi allontanata dalla sovrana. La partenza della dama è salutata dalle dolci parole di Elisabetta (Aria: Non pianger, mia compagna). Filippo ingiunge al marchese di Posa di trattenersi con lui. Restati soli, Rodrigo narra al sovrano la triste condizione in cui versano le Fiandre e lo invita a concedere l’autonomia a quei territori. Il monarca non accoglie tale richiesta, ma – dopo avergli ricordato il terribile potere del Grande Inquisitore – rivela al marchese le proprie pene: egli è conscio del sentimento che lega Carlo a Elisabetta e incarica Rodrigo di sorvegliare la giovane coppia. Il marchese accoglie con gioia la proposta del re che lo congeda, dopo averlo messo nuovamente in guardia contro il Grande Inquisitore (Duetto:O signor, di Fiandra arrivo).