Galleria nel palagio di Westminster.
Dopo un intenso preludio, il sipario si apre sul coro festoso dei cortigiani in attesa della regina che infatti non tarda ad arrivare. Elisabetta è però perplessa: ha ricevuto una proposta di matrimonio da parte del re di Francia, ma è in realtà innamorata del conte di Leicester. Lord Talbot le ricorda l’infelice sorte della regina di Scozia, Maria Stuarda, tenuta prigioniera nel castello di Forteringa; Lord Cecil, invocando la ragion di stato, le consiglia invece di essere impietosa con la sua nemica. Arriva Leicester che, dopo una breve scena con la sospettosa e gelosa Elisabetta, resta solo con Talbot. Quest’ultimo gli racconta di essere stato da Maria e di aver ricevuto un ritratto e una lettera per lui. Leicester è turbato e commosso: ama infatti segretamente la regina di Scozia. Sta per uscire di scena quando incontra Elisabetta: egli cerca di intercedere a favore della Stuarda, ma riesce solo a esasperare la gelosia della regina, che accetta però di incontrare personalmente la nemica.

Parco di Forteringa.
Controllata a vista dalle guardie, Maria Stuarda respira un po’ di libertà nel parco di Forteringa, invocando nostalgicamente la giovinezza e i «bei lidi di Francia» ormai lontani. Di colpo si odono un coro e una fanfara di caccia: Elisabetta e il suo seguito si avvicinano. Un duetto tra Leicester e Maria ritarda ancora l’incontro fatidico tra le due regine.
Ma ecco che entra Elisabetta con il folto seguito di cortigiani. Costei tratta con orgoglioso disprezzo la rivale che pure si era prostrata ai suoi piedi. Maria allora si alza e reagisce insultando davanti a tutti la regina. L’offesa è tale da rendere ormai inevitabile la condanna a morte della Stuarda.